KOLONIES!!!

Na lang wachten, is mij nieuwe vector vorige week eindelijk binnen gekomen. Omdat ik in mijn vorig blogbericht aanhaalde dat de transformatie via de klassiek digestie/ligatie niet gelukt is, werd ook een andere methode (Gibson klonering) getest.

Voor deze methode wordt een PCR met specifieke primers uitgevoerd, om daarna na de assembly reactie te transformeren. Dit werd eerst getest met één contig en via deze methode kwam ik eindelijk kolonies uit :). Zo hebben we dan ook besloten om de overige vier contig's op dezelfde manier te transformeren. Maar het zou niet mogen zijn, dat we natuurlijk ook nog iets anders proberen om sneller vooruit te kunnen. De transformatie voor Gibson klonering gebeurd in E.Coli 5-alpha competente cellen, deze kunnen niet gebruikt worden om later een IPTG-inductie op uit te voeren,  dus zouden deze eerst nog getransformeerd moeten worden naar andere E.Coli cellen, namelijke de BL21(DE3). Daarom werd met een andere contig de transformatie getest in zowel de 5-alpha als de BL21(DE3). En Jawel, ik kom ook kolonies uit bij de BL21(DE3)!! Na de transformatie is het de bedoeling om te kijken of mijn insert wel degelijk is ingebouwd in mijn vector. Dit gebeurd door een kolonie PCR uit te voeren om daarna op gel te bekijken. Na de kolonie PCR wordt een overnachtcultuur ingezet om dan vervolgens te sequensen en IPTG-inductie (eiwit maken) uit te voeren. Het sequensen heb ik voor de eerste contig die getransformeerd werd uitgevoerd. Hierbij was het resultaat van de reverse primer goed, maar de forward niet. Zo heb ik met mijn lege vector de forward en de reverse primer via sequensen gecontroleerd. Hierbij kom ik voor mijn forward primer weer niet goed uit, dus zal er waarschijnlijk een nieuwe primer ontwikkeld en besteld moeten worden. Maar eindelijk kan ik dus verder met mijn experiment, nu ik mijn nieuwe vector en kolonies heb. Zo kan ik misschien volgende week of binnen twee weken beginnen met eiwitten maken en deze via SDS-page en Western Blotting analyseren :).